Anticorpo anti-HCG umano IgA (HCG-IGA) ELISA
Le istruzioni del kit per l'uso di questo reagente sono solo per l'uso della ricerca
Scopo: questo kit viene utilizzato per determinare il contenuto di IgA anticorpi anti-HCG (HCG-IGA) nel siero umano, nel plasma e nei correlati campioni liquidi.
Principio sperimentale:
Questo kit utilizza il metodo sandwich a doppio anticorpo per determinare il livello di IgA anticorpo anti-HCG umano (HCG-IGA) nel campione. Le piastre microporose sono state rivestite con anticorpo IgA anti-HCG umano purificato (HCG-IGA) per preparare anticorpi in fase solida. L'anticorpo anti-HCG IgA (HCG-IGA) è stato aggiunto ai microwell rivestiti con MAB a sua volta, e quindi etichettata con HRP l'anticorpo anti-umano di capra si lega a formare un complesso anticorpo anticorpo-antigene-antigene-anzimatico. Dopo un lavaggio approfondito, viene aggiunto la TMB del substrato per lo sviluppo del colore. TMB viene convertito in blu sotto la catalisi dell'enzima HRP e nel giallo finale sotto l'azione dell'acido. La profondità del colore è positivamente correlata con l'anticorpo anti-HCG IgA (HCG-IGA) nel campione. L'assorbanza (valore OD) è stata misurata con un lettore di micropiastre a una lunghezza d'onda di 450 nM e la concentrazione di IgA anticorpi anti-HCG umana (HCG-IGA) nel campione è stata calcolata da una curva standard.
Composizione del kit:
Kit Composizione 48 Well Configurazione 96 istruzioni di archiviazione della configurazione Well 1 Parte 1 Film di piastra di tenuta part 2 pezzi (48) 2 pezzi (96)
Un sacchetto sigillato e una piastra di rivestimento con etichetta con enzima 1 × 48 1 × 96 2-8 ℃ Standard conservata: 54pg / ml 0,5 ml × 1 bottiglia 0,5 ml × 1 diluente standard conservato 1,5 ml × 2-8 ℃ ℃ × 1 bottiglia di 1,5 Ml × 1 bottiglia di reagenti marcati con enzimi conservati a 2-8 ℃ 3 ml × 1 bottiglia di 6 ml × 1 bottiglie di diluente campione a 2-8 ℃ 3 ml × 1 bottiglia di 6 ml × 1 di conservazione a colori a 2 -8 ℃ Reagente Una soluzione 3 ml × 1 bottiglia 6 ml × 1 bottiglia 2-8 ° C Soluzione di stoccaggio B Soluzione 3 ml × 1 bottiglia 6 ml × 1 bottiglia 2-8 ° C Soluzione di arresto di stoccaggio 3 ml × 1 bottiglia 6 ml × 1 Bottiglia 2- Conservare la soluzione di lavaggio concentrata a 8 ℃ (20 ml × 20 volte) × 1 bottiglia (20 ml × 30 volte) × 1 bottiglia a 2-8 ℃
1. siero: il sangue a temperatura ambiente si coagula naturalmente per 10-20 minuti, centrifugato per circa 20 minuti (2000-3000 giri / min). Raccogli attentamente il surnatante e centrifuga se viene visualizzato un precipitato durante lo stoccaggio.
2. Plasma: il citrato EDTA o sodio deve essere selezionato come anticoagulante secondo i requisiti del campione, miscelato per 10-20 minuti e centrifugato per circa 20 minuti (2000-3000 giri / min). Raccogli attentamente il surnatante. Se un precipitato si forma durante lo stoccaggio, dovrebbe essere nuovamente centrifugato.
3. URINE: raccolto in provette sterili e centrifugate per circa 20 minuti (2000-3000 giri / min). Raccogli attentamente il surnatante. Se un precipitato si forma durante lo stoccaggio, centrifuga di nuovo. Implementazione di riferimento del fluido pleurico e ascite, cerebrospinale.
4. Supernatante di coltura cellulare: quando si rilevano componenti secreti, raccogliere con un tubo sterile. Centrifuga per circa 20 minuti (2000-3000 giri / min). Raccogli attentamente il surnatante. Quando si rilevano i componenti all'interno delle cellule, diluire la sospensione cellulare con PBS (PH7.2-7.4) e la concentrazione cellulare raggiungerà circa 1 milione / mL. Attraverso ripetuti congelamento e scongelamento, le cellule vengono distrutte e i componenti intracellulari vengono rilasciati. Centrifuga per circa 20 minuti (2000-3000 giri / min). Raccogli attentamente il surnatante. Se un precipitato si forma durante lo stoccaggio, dovrebbe essere nuovamente centrifugato.
5. Organizzare il campione: dopo aver tagliato il campione, peserlo. Aggiungi una certa quantità di PBS, ph7.4. Congelare rapidamente e risparmiare con azoto liquido per un uso successivo. Dopo che il campione si scioglie, mantiene ancora una temperatura di 2-8 ° C. Aggiungere una certa quantità di PBS (ph7.4) e omogeneizzare il campione con un manuale o omogeneizzatore. Centrifuga per circa 20 minuti (2000-3000 giri / min). Raccogli attentamente il surnatante. Dopo l'alquota, una parte deve essere testata e il resto viene congelato per un uso futuro.
6. Il campione deve essere estratto il prima possibile dopo la raccolta. L'estrazione dovrebbe essere effettuata in base alla letteratura pertinente. L'esperimento dovrebbe essere condotto il prima possibile dopo l'estrazione. Se il test non può essere eseguito immediatamente, il campione può essere conservato a -20 ℃, ma si dovrebbe evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti.
7. Il campione contenente NAN3 non può essere rilevato perché NAN3 inibisce l'attività della perossidasi di rafano (HRP).
Passaggi:
1. diluizione e carico di prodotti standard: impostare 10 pozzi standard sulla piastra rivestita di enzimi, aggiungere 100 μL dei prodotti standard nel primo e secondo pozzi, quindi aggiungi i prodotti standard nel primo e nel secondo pozzetto. 50 μl di diluente, mescolare bene; Quindi prendere 100 μl dal primo pozzo e il secondo e aggiungerli rispettivamente al terzo e quarto pozzo, quindi aggiungi 50 μl di soluzione di diluizione standard rispettivamente al terzo e quarto pozzo, mescola bene, quindi prendi 50 μl ciascuno nel terzo e quarto pozzi e scartalo, quindi aggiungi 50 μl ciascuno al quinto e sesto pozzi, quindi aggiungi 50ul della soluzione di diluizione standard rispettivamente al quinto e sesto pozzi e mescola bene; Dopo la miscelazione, prendi 50 μl dal quinto e sesto pozzi e aggiungili rispettivamente al settimo e all'ottavo pozzi. Quindi aggiungere 50 μl di soluzione di diluizione standard rispettivamente al settimo e all'ottavo pozzi. Prendi 50 μl dagli otto pozzi e aggiungili al nono e al decimo pozzi. Quindi aggiungere 50 μl della soluzione di diluizione standard rispettivamente al nono e ai decimi pozzi. Dopo la miscelazione, prendi 50 μl dal nono e decimo pozzi e scarta. (Dopo la diluizione, il volume di ciascun pozzetto è 50 μl e le concentrazioni sono 36pg / mL, 24pg / ml, 12pg / ml, 6pg / ml, 3pg / mL).
2. Aggiungi campioni: impostare pozzi vuoti (i pozzi di controllo vuoti non aggiungono campioni e reagenti enzimatici, il resto dei passaggi sono uguali) e i pozzi di campionamento da testare. Aggiungi 40 μL di diluente del campione al pozzo del campione di prova della piastra rivestita di enzimi, quindi aggiungi 10 μl del campione di prova (la diluizione finale del campione è 5 volte). Aggiungi il campione e aggiungi il campione nella parte inferiore del pozzo del micropiastra, cerca di non toccare il muro del pozzo, agitare delicatamente per mescolare.
3. Incubazione: sigillare la piastra con la pellicola di tenuta e incubare a 37 ° C per 30 minuti.
4. Soluzione di miscelazione: diluire 30 volte (20 volte di 48T) liquido di lavaggio concentrato con acqua distillata 30 volte (20 volte di 48T) e quindi utilizzare.
5. Lavaggio: staccare con cura la pellicola di tenuta, scartare il liquido, asciugare, riempire ogni pozzo con la soluzione di lavaggio, lasciarlo stare per 30 secondi e scartare, ripetere 5 volte e asciugare.
6. Aggiungi enzima: aggiungi 50 μl di reagente dell'etichetta enzimatica a ciascun pozzetto, tranne che in bianco.
7. Incubazione: l'operazione è uguale a 3.
8. Lavaggio: l'operazione è uguale a 5.
9. Sviluppo del colore: aggiungi 50 μl di sviluppatore A a ciascun pozzetto, quindi aggiungi 50 μl di sviluppatore B, mescola delicatamente e visualizzi a 37 ℃ per 15 minuti al buio.
10. Terminatura: aggiungere 50 μl di soluzione di arresto a ciascun pozzetto per fermare la reazione (in questo momento il blu si rivolgerà al giallo).
11. Determinazione: misurare l'assorbanza (valore OD) di ciascun pozzetto in sequenza con il condizionatore d'aria vuoto a zero e lunghezza d'onda di 450 nm. La misurazione deve essere eseguita entro 15 minuti dall'aggiunta della soluzione finale.
Precauzioni:
1. Il kit deve essere equilibrato a temperatura ambiente per 15-30 minuti prima di essere portato fuori dall'ambiente refrigerato. Se la piastra rivestita con l'etichetta enzimatica non è aperta, la striscia deve essere conservata in una borsa sigillata.
2. I cristalli possono essere precipitati nel liquido di lavaggio concentrato, che può essere riscaldato e sciolto in un bagno d'acqua durante la diluizione e i risultati non saranno influenzati durante il lavaggio.
3. Il campionatore deve essere utilizzato ad ogni fase dell'aggiunta del campione e l'accuratezza deve essere regolarmente verificata per evitare errori di prova. È meglio controllare il tempo di campionamento entro 5 minuti. Se ci sono molti esemplari, si consiglia di utilizzare una pistola per il tiro al volo per aggiungere campioni.
4. Si prega di creare una curva standard contemporaneamente a ciascuna misurazione, è meglio creare un doppio foro. Se il contenuto della sostanza da testare nel campione è troppo elevato (il valore OD del campione è maggiore del valore OD del primo pozzo del pozzetto standard), si prega di diluirlo con un determinato multiplo (n volte) il diluente del campione e quindi determinarlo. Multiplo (× n × 5).
5. Il film di tenuta è limitato all'uso una tantum per evitare la contaminazione incrociata.
6. Tenere il substrato lontano dalla luce.
7. Seguire rigorosamente le istruzioni e i risultati del test devono essere determinati dal lettore di micropiastre.
8. Tutti i campioni, il lavaggio di liquidi e vari rifiuti dovrebbero essere trattati come agenti infettivi.
9. I componenti di diversi lotti di questo reagente non devono essere miscelati.
10. Se c'è qualche differenza con il manuale inglese, prevarrà il manuale inglese.
Calcolo:
Prendendo la concentrazione dello standard come ascissa e valore OD come ordinata, disegnare una curva standard sulla carta di coordinate e trova la concentrazione corrispondente dalla curva standard in base al valore OD del campione; quindi moltiplicarsi per il fattore di diluizione; Calcola l'equazione di regressione lineare della curva standard con il valore OD, sostituisci il valore OD del campione nell'equazione, calcola la concentrazione del campione e moltiplicalo per il fattore di diluizione per ottenere la concentrazione effettiva del campione.
(Questa immagine è solo per riferimento)
Performance del kit:
1. Il coefficiente di correlazione R tra la regressione lineare del campione e la concentrazione prevista è superiore a 0,990.
2. Il lotto e l'approvazione devono essere rispettivamente inferiori al 9% e all'11%
intervallo di esame:
1pg / ml -45pg / ml
Condizioni di stoccaggio e periodo di validità:
1. Conservare il kit: 2-8 ℃.
2. Validità: 6 mesi