Menselijke anti-HCG-antilichaam IGA (HCG-IGA) ELISA
KIT -instructies voor gebruik Dit reagens is alleen voor onderzoeksgebruik
Doel: deze kit wordt gebruikt om het gehalte aan anti-HCG-antilichaam IGA (HCG-IgA) in menselijk serum, plasma en gerelateerde vloeibare monsters te bepalen.
Experimenteel principe:
Deze kit gebruikt de sandwichmethode met dubbele antilichamen om het niveau van menselijke anti-HCG-antilichaam IgA (HCG-IgA) in het monster te bepalen. Microporeuze platen werden gecoat met gezuiverde menselijke anti-HCG-antilichaam IGA (HCG-IgA) antilichaam om vaste fase-antilichamen te bereiden. Anti-HCG-antilichaam IGA (HCG-IgA) werd op de beurt aan de microwells gecoat met mAb toegevoegd en vervolgens met HRP gelabeld het geit anti-menselijke antilichaam bindt om een antilichaam-antigen-enzym-gelabeld antilichaamcomplex te vormen. Na grondig wassen wordt de substraat TMB toegevoegd voor kleurontwikkeling. TMB wordt omgezet in blauw onder de katalyse van HRP -enzym en in het uiteindelijke geel onder de werking van zuur. De kleurdiepte is positief gecorreleerd met het anti-HCG-antilichaam IgA (HCG-IgA) in het monster. De absorptie (OD-waarde) werd gemeten met een microplaatlezer bij een golflengte van 450 nM en de concentratie van menselijke anti-HCG-antilichaam IGA (HCG-IgA) in het monster werd berekend door een standaardcurve.
Kitcompositie:
Kit Samenstelling 48 Well Configuratie 96 Well Configuration Storage Instructies 1 Deel 1 Deel afdichting Plaat Film 2 stuks (48) 2 stuks (96)
Eén afgesloten zak en één enzym-gelabelde coatingplaat 1 × 48 1 × 96 2-8 ℃ Gedeeld standaard: 54 pg / ml 0,5 ml × 1 fles 0,5 ml × 1 bewaarde standaard verdunningsdunn 1,5 ml × 2-8 ℃ × 1 fles van 1,5 Ml × 1 fles enzym-gelabelde reagentia bewaard bij 2-8 ℃ 3 ml × 1 fles van 6 ml x 1 flessen monsterverdunnend bij 2-8 ℃ 3 ml x 1 fles van 6 ml x 1 flessen kleuropslag bij 2 bij 2 -8 ℃ reagens A oplossing 3 ml × 1 fles 6 ml × 1 fles 2-8 ° C Opslagontwikkelaar B Oplossing 3 ml × 1 fles 6 ml x 1 fles 2-8 ° C Opslagoplossing 3 ml x 1 fles 6 ml x 1 fles 2- Bewaar de geconcentreerde wasoplossing bij 8 ℃ (20 ml x 20 keer) × 1 fles (20 ml x 30 keer) × 1 fles bij 2-8 ℃
1. Serum: bloedtemperatuur bloed coaguleert op natuurlijke wijze gedurende 10-20 minuten, ongeveer 20 minuten gecentrifugeerd (2000-3000 tpm). Verzamel het supernatant zorgvuldig en centrifugeer opnieuw als er een neerslag verschijnt tijdens opslag.
2. Plasma: EDTA of natriumcitraat moet worden geselecteerd als het anticoagulans volgens de vereisten van het monster, gemengd gedurende 10-20 minuten en ongeveer 20 minuten gecentrifugeerd (2000-3000 tpm). Verzamel het supernatant zorgvuldig. Als een neerslag zich tijdens de opslag vormt, moet dit opnieuw worden gecentrifugeerd.
3. Urine: verzameld in steriele buizen en ongeveer 20 minuten gecentrifugeerd (2000-3000 tpm). Verzamel het supernatant zorgvuldig. Als er een neerslag ontstaat tijdens opslag, centrifuge opnieuw. Pleurale en ascites, cerebrospinale vloeistofreferentie -implementatie.
4. Supernatant van de celcultuur: verzamel bij het detecteren van uitgescheiden componenten met een steriele buis. Centrifuge gedurende ongeveer 20 minuten (2000-3000 tpm). Verzamel het supernatant zorgvuldig. Bij het detecteren van de componenten in de cellen, verdun de celsuspensie met PBS (PH7.2-7.4) en de celconcentratie zal ongeveer 1 miljoen / ml bereiken. Door herhaald bevriezen en ontdooien worden de cellen vernietigd en worden de intracellulaire componenten vrijgegeven. Centrifuge gedurende ongeveer 20 minuten (2000-3000 tpm). Verzamel het supernatant zorgvuldig. Als een neerslag zich tijdens de opslag vormt, moet dit opnieuw worden gecentrifugeerd.
5. Organiseer het monster: weeg het na het snijden van het monster. Voeg een bepaalde hoeveelheid PBS toe, ph7.4. Vries snel en bewaar met vloeibare stikstof voor later gebruik. Nadat het monster smolt, handhaaft het nog steeds een temperatuur van 2-8 ° C. Voeg een bepaalde hoeveelheid PBS (PH7.4) toe en homogeniseren het monster met een handleiding of homogenisator. Centrifuge gedurende ongeveer 20 minuten (2000-3000 tpm). Verzamel het supernatant zorgvuldig. Na een portie moet een deel worden getest en is de rest ingevroren voor toekomstig gebruik.
6. Het monster moet na het verzamelen zo snel mogelijk worden geëxtraheerd. De extractie moet worden uitgevoerd volgens de relevante literatuur. Het experiment moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd na extractie. Als de test niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd, kan het monster worden opgeslagen bij -20 ℃, maar herhaald bevriezing en ontdooien moeten worden vermeden.
7. Het monster met NAN3 kan niet worden gedetecteerd omdat Nan3 de activiteit van mierikswortelperoxidase (HRP) remt.
Stappen:
1. Verdunning en laad van standaardproducten: stel 10 standaardputten in op de enzym-gecoate plaat, voeg 100 ul van de standaardproducten toe in de eerste en tweede putten en voeg vervolgens de standaardproducten toe aan de eerste en tweede putten. 50μl verdunningsmiddel, goed mengen; Neem dan 100 ul vanaf de eerste put en de tweede put en voeg ze toe aan respectievelijk de derde en vierde putten, en voeg vervolgens 50 ul standaard verdunningsoplossing toe aan respectievelijk de derde en vierde putten, meng goed en neem dan 50μl elk in de derde en vierde putten en gooi het weg, voeg dan elk 50 ul toe aan de vijfde en zesde putten, en voeg vervolgens 50Ul van de standaard verdunningsoplossing toe aan respectievelijk de vijfde en zesde putten, en meng goed; Neem na het mengen, neem 50μl van de vijfde en zesde putten en voeg ze toe aan respectievelijk de zevende en achtste putten. Voeg vervolgens 50 ul standaard verdunningsoplossing toe aan respectievelijk de zevende en achtste putten. Neem 50 ul van de acht putten en voeg ze toe aan de negende en tiende putten. Voeg vervolgens 50 ul van de standaard verdunningsoplossing toe aan respectievelijk de negende en tiende putten. Neem na het mengen, neem 50μl van de negende en tiende putten en gooi weg. (Na verdunning is het volume van elke putje 50 μl en de concentraties zijn 36 pg / ml, 24 pg / ml, 12 pg / ml, 6pg / ml, 3 pg / ml).
2. Toevoeg monsters: stel lege putten in (de lege besturingsputjes voegen geen monsters en enzymreagentia toe, de rest van de stappen zijn hetzelfde) en de te testen monsterputten. Voeg 40 μl monsterverdunnend toe aan het testmonsterput van de enzym-gecoate plaat en voeg vervolgens 10 μl van het testmonster toe (de uiteindelijke verdunning van het monster is 5 keer). Voeg het monster toe en voeg het monster toe aan de onderkant van de put van de microplaat, probeer de wand van de put niet aan te raken, schud zachtjes om te mengen.
3. Incubatie: sluit de plaat af met de afdichtingsfilm en incubeer 30 minuten bij 37 ° C.
4. Mengoplossing: verdun 30 keer (20 keer van 48 t) geconcentreerde wasvloeistof met gedestilleerd water 30 keer (20 keer van 48 t) en gebruik vervolgens.
5. Wasen: pel de afdichtingsfilm zorgvuldig af, gooi de vloeistof weg, draai droog, vul elk put met de wasoplossing, laat het 30 seconden staan en weggooien, herhaal 5 keer en klop droog.
6. Voeg enzym toe: voeg 50μl enzymlabelreagens toe aan elk putje, behalve blanco goed.
7. Incubatie: de bewerking is dezelfde als 3.
8. Wassen: de bewerking is dezelfde als 5.
9. Kleurontwikkeling: voeg 50μl ontwikkelaar A toe aan elk putje en voeg vervolgens 50 ul ontwikkelaar B toe, meng zachtjes en geef gedurende 15 minuten in het donker op 37 ℃.
10. Beëindiging: voeg 50 ul stopoplossing toe aan elk putje om de reactie te stoppen (op dit moment wordt het blauw geel).
11. Bepaling: meet de absorptie (OD -waarde) van elke put in volgorde met de lege airconditioner bij nul en 450 nm golflengte. De meting moet binnen 15 minuten na het toevoegen van de uiteindelijke oplossing worden uitgevoerd.
Preventieve maatregelen:
1. De kit moet 15-30 minuten bij kamertemperatuur worden geëquilibreerd voordat ze uit de gekoelde omgeving worden gehaald. Als het enzymlabelcoate plaat niet is geopend, moet de strook worden bewaard in een afgesloten zak.
2. Kristallen kunnen worden neergeslagen in de geconcentreerde wasvloeistof, die kan worden verwarmd en opgelost in een waterbad tijdens verdunning, en de resultaten worden niet beïnvloed tijdens het wassen.
3. De sampler moet worden gebruikt bij elke stap van de monster -toevoeging en de nauwkeurigheid moet regelmatig worden gecontroleerd om testfouten te voorkomen. Het is het beste om de bemonsteringstijd binnen 5 minuten te regelen. Als er veel exemplaren zijn, wordt het aanbevolen om een volleypistool te gebruiken om monsters toe te voegen.
4. Maak een standaardcurve tegelijkertijd van elke meting, het is het beste om een dubbel gat te maken. Als de inhoud van de te testen stof in het monster te hoog is (de OD -waarde van het monster is groter dan de OD -waarde van de eerste put van de standaardput), verdun deze dan met een bepaald meerdere (n keer) van het monster verdunningsmiddel en bepaal het vervolgens. Meerdere (× N × 5).
5. De afdichtingsfilm is beperkt tot eenmalig gebruik om kruisbesmetting te voorkomen.
6. Houd het substraat uit de buurt van licht.
7. Volg de instructies strikt en de testresultaten moeten worden bepaald door de microplaatlezer.
8. Alle monsters, het wassen van vloeistoffen en verschillende afvalstoffen moeten worden behandeld als besmettelijke middelen.
9. De componenten van verschillende batches van dit reagens mogen niet worden gemengd.
10. Als er een verschil is met de Engelse handleiding, zal de Engelse handleiding de overhand hebben.
Berekening:
De concentratie van de standaard als de abscis en de OD -waarde als de ordinaat nemen, teken een standaardcurve op het coördinaatpapier en vind de overeenkomstige concentratie uit de standaardcurve volgens de OD -waarde van het monster; Vermenigvuldig vervolgens met de verdunningsfactor; Bereken de lineaire regressievergelijking van de standaardcurve door de OD -waarde, vervang de OD -waarde van het monster in de vergelijking, bereken de monsterconcentratie en vermenigvuldig deze met de verdunningsfactor om de werkelijke concentratie van het monster te verkrijgen.
(Deze foto is alleen ter referentie)
Kitprestaties:
1. De correlatiecoëfficiënt R tussen de lineaire regressie van het monster en de verwachte concentratie is meer dan 0,990.
2. De batch en goedkeuring zijn respectievelijk minder dan 9% en 11%
Onderzoeksbereik:
1pg / ml -45pg / ml
Opslagomstandigheden en geldigheidsperiode:
1. Bewaar de kit: 2-8 ℃.
2. Geldigheid: 6 maanden