Ludzkie przeciwciało przeciw HCG IGA (HCG-IGA) ELISA
Instrukcje dotyczące korzystania z tego odczynnika służy wyłącznie do użytku badawczego
Cel: Zestaw ten służy do określenia zawartości przeciwciał przeciw HCG IGA (HCG-IGA) w ludzkiej surowicy, osoczu i powiązanych próbkach cieczy.
Zasada eksperymentalna:
Zestaw ten wykorzystuje metodę kanapki z podwójnym przeciwciałem do określenia poziomu ludzkiego przeciwciała anty-HCG IGA (HCG-IGA) w próbce. Płytki mikroporowate powleczono oczyszczonym ludzkim przeciwciałem przeciw HCG IgA (HCG-IGA) w celu przygotowania przeciwciał w fazie stałej. IgA przeciwciała anty-HCG (HCG-IGA) dodano z kolei do mikrowinków pokrytych mAb, a następnie znakowano HRP kozie przeciwciało przeciw ludzkiemu wiąże się z utworzeniem kompleksu przeciwciała znakowanego przeciwciałem-antygenem. Po dokładnym przemyciu podłoże TMB jest dodawane do rozwoju kolorów. TMB jest przekształcany w niebieski pod katalizą enzymu HRP i na końcowy żółty pod działaniem kwasu. Głębokość kolorów jest dodatnio skorelowana z IgA przeciwciała anty-HCG (HCG-IGA) w próbce. Absorbancję (wartość OD) zmierzono za pomocą czytnika mikropłytek o długości fali 450 nm, a stężenie ludzkiego przeciwciała anty-HCG IgA (HCG-IGA) w próbce obliczono za pomocą krzywej standardowej.
Kompozycja zestawu:
Kompozycja zestawu 48 Konfiguracja studni 96 Konfiguracja Instrukcje przechowywania 1 Część 1 część Płyta uszczelniająca 2 sztuki (48) 2 sztuki (96)
Jedna zapieczętowana torba i jedna płyta powłoki znakowanej enzymem 1 × 48 1 × 96 2-8 ℃ Zachowana standard: 54pg / ml 0,5 ml × 1 butelka 0,5 ml × 1 Zachowany standardowy rozcieńczenie 1,5 ml × 2-8 ℃ × 1 butelka 1,5 ML × 1 butelka odczynników znakowanych enzymatycznymi przechowywana przy 2-8 ℃ 3 ml × 1 butelki 6 ml × 1 rozcieńczalnika próbki przy 2-8 ℃ 3 ml × 1 butelka 6 ml × 1 butelki do przechowywania kolorów przy 2 -8 ℃ Odczynnik Roztwór 3 ml × 1 butelka 6 ml × 1 butelka 2-8 ° C Dewelarage B Roztwór 3 ml × 1 butelka 6 ml × 1 butelka 2-8 ° C Stop Roztwór 3 ml × 1 butelka 6 ml × 1 Butelka 2- Przechowuj skoncentrowane roztwór mycia przy 8 ℃ (20 ml × 20 razy) × 1 Butelka (20 ml × 30 razy) × 1 butelka przy 2-8 ℃
1. Serum: Krew w temperaturze pokojowej naturalnie koaguluje przez 10-20 minut, odwirowana przez około 20 minut (2000-3000 obr / min). Ostrożnie zebraj supernatantu i ponownie wirować, jeśli podczas przechowywania pojawi się osad.
2. Plazma: EDTA lub cytrynian sodu należy wybierać jako antykoagulant zgodnie z wymaganiami próbki, zmieszane przez 10-20 minut i odwirowane przez około 20 minut (2000-3000 obr / min). Ostrożnie zbierz supernatanta. Jeśli podczas przechowywania powstaje osad, powinien zostać ponownie wirowany.
3. Mocz: zebrane w sterylnych rurach i wirowane przez około 20 minut (2000-3000 rpm). Ostrożnie zbierz supernatanta. Jeśli podczas przechowywania powstaje osad, ponownie wirować. Płuc i wodobrzusze, wdrożenie referencyjne płynu mózgowo -rdzeniowego.
4. Supernatant hodowli komórkowej: podczas wykrywania wydzielanych komponentów zbieraj sterylną rurką. Centrifuge przez około 20 minut (2000-3000 obr / min). Ostrożnie zbierz supernatanta. Podczas wykrywania składników wewnątrz komórek rozcieńcz zawieszenie komórek PBS (pH7,2-7.4), a stężenie komórki osiągnie około 1 miliona / ml. Poprzez powtarzające się zamrażanie i rozmrażanie komórki są niszczone, a składniki wewnątrzkomórkowe są uwalniane. Centrifuge przez około 20 minut (2000-3000 obr / min). Ostrożnie zbierz supernatanta. Jeśli podczas przechowywania powstaje osad, powinien zostać ponownie wirowany.
5. Zorganizuj próbkę: Po wycięciu okazu zważy go. Dodaj pewną ilość PBS, pH7.4. Szybko zamrażaj i oszczędzaj z ciekłym azotem do późniejszego użycia. Po stopieniu próbki nadal utrzymuje temperaturę 2-8 ° C dodaj określoną ilość PBS (pH7,4) i homogenizuj próbkę za pomocą manualnego lub homogenizatora. Centrifuge przez około 20 minut (2000-3000 obr / min). Ostrożnie zbierz supernatanta. Po porodzie należy przetestować porcję, a reszta jest zamrożona do przyszłego użycia.
6. Próbkę należy wyodrębnić jak najszybciej po pobraniu. Ekstrakcję należy przeprowadzić zgodnie z odpowiednią literaturą. Eksperyment należy przeprowadzić jak najszybciej po ekstrakcji. Jeśli test nie może zostać wykonany natychmiast, próbkę można przechowywać w temperaturze -20 ℃, ale należy unikać powtarzającego się zamrażania i rozmrożenia.
7. Próbki zawierającej NAN3 nie można wykryć, ponieważ NAN3 hamuje aktywność peroksydazy chrzanowej (HRP).
Kroki:
1. Rozcieńczenie i ładowanie standardowych produktów: Ustaw 10 standardowych studzienek na płytce powlekanej enzymatycznej, dodaj 100 μl standardowych produktów w pierwszym i drugim studzience, a następnie dodaj standardowe produkty w pierwszym i drugim studzience. 50 μl rozcieńczonego, dobrze wymieszaj; Następnie weź 100 μl z pierwszej studni i drugiej studni i dodaj je odpowiednio do trzeciego i czwartego studzienki, a następnie dodaj 50 μl standardowego roztworu rozcieńczenia odpowiednio do trzeciego i czwartego studzienki, a następnie dobrze weź 50 μl w trzecim i czwartym studzience i odrzuć go, a następnie dodaj 50 μl do piątej i szóstej studzienki, a następnie dodaj 50ul standardowego roztworu rozcieńczenia odpowiednio do piątej i szóstej studni, i dobrze wymieszaj; Po zmieszaniu weź 50 μl ze piątych i szóstej studni i dodaj je odpowiednio do siódmego i ósmego studni. Następnie dodaj 50 μl standardowego roztworu rozcieńczenia odpowiednio do siódmego i ósmego studzienki. Weź 50 μl z ośmiu studzienek i dodaj je do dziewiątej i dziesiątej studni. Następnie dodaj 50 μl standardowego roztworu rozcieńczenia odpowiednio dziewiątych i dziesiątych studzienki. Po zmieszaniu weź 50 μl z dziewiątych i dziesiątych studzienek i odrzucić. (Po rozcieńczeniu objętość każdej studzienki wynosi 50 μl, a stężenia wynosi 36pg / ml, 24 pg / ml, 12pg / ml, 6pg / ml, 3pg / ml).
2. Dodaj próbki: Ustaw puste studzienki (puste studzienki sterujące nie dodają próbek i odczynników enzymowych, reszta kroków jest takie same) i testowane studnie. Dodaj 40 μl rozcieńczalnika próbki do studni próbki testowej płyty powlekanej enzymem, a następnie dodaj 10 μl próbki testowej (końcowe rozcieńczenie próbki wynosi 5 razy). Dodaj próbkę i dodaj próbkę do dna studni mikropłytek, staraj się nie dotykać ściany studni, delikatnie wstrząśnij, aby się wymieszać.
3. Inkubacja: uszczelnij płytkę folią uszczelniającą i inkubuj w 37 ° C przez 30 minut.
4. Roztwór mieszania: rozcieńcz 30 razy (20 razy 48T) stężona ciecz prania z wodą destylowaną 30 razy (20 razy 48T), a następnie użyć.
5. Mycie: Ostrożnie zdejmij folię uszczelniającą, odrzuć płyn, sucha, napełnij każdą studnię roztworem mycia, pozwól mu stać przez 30 sekund i odrzucić, powtórz 5 razy i osuszają.
6. Dodaj enzym: Dodaj 50 μl odczynnika etykiety enzymu do każdej studzienki, z wyjątkiem pustej studni.
7. Inkubacja: Operacja jest taka sama jak 3.
8. Mycie: Operacja jest taka sama jak 5.
9. Rozwój koloru: Dodaj 50 μl programisty A do każdej studzienki, a następnie dodaj 50 μl programisty B, delikatnie wymieszaj i wyświetl się na 37 ℃ przez 15 minut w ciemności.
10. Zakończenie: Dodaj 50 μl roztworu stop do każdej studni, aby zatrzymać reakcję (w tym czasie niebieski przejdzie do żółtego).
11. Określenie: Zmierz absorbancję (wartość OD) każdej studzienki w sekwencji za pomocą pustego klimatyzatora przy zerowej i 450 nm długości fali. Pomiar należy wykonać w ciągu 15 minut po dodaniu ostatecznego rozwiązania.
Środki ostrożności:
1. Zestaw powinien być równoważony w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut, zanim został wyjęty z środowiska chłodzonego. Jeśli płyta powlekana enzymem jest nieotwarta, pasek należy przechowywać w zamkniętej torbie.
2. Kryształy mogą być wytrącone w skoncentrowanej cieczy prania, którą można ogrzewać i rozpuszczać w łaźni wodnej podczas rozcieńczenia, a na wyniki nie będą miały wpływu podczas mycia.
3. Sampler należy użyć na każdym etapie dodawania próbki, a dokładność należy regularnie sprawdzać, aby uniknąć błędów testowych. Najlepiej jest kontrolować czas próbkowania w ciągu 5 minut. Jeśli istnieje wiele próbek, zaleca się użycie pistoletu w siatkówce do dodawania próbek.
4. Proszę wykonać krzywą standardową w tym samym czasie każdego pomiaru, najlepiej zrobić podwójną dziurę. Jeśli zawartość substancji, która ma być testowana w próbce, jest zbyt wysoka (wartość OD próbki jest większa niż wartość OD pierwszej studni standardowej), rozcieńcz ją za pomocą określonej wielokrotności (n razy) Próbka rozcieńczona, a następnie określa ją. Wiele (× n × 5).
5. Film uszczelniający jest ograniczony do jednorazowego użytku, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
6. Proszę, trzymaj podłoże z dala od światła.
7. Ściśle przestrzegaj instrukcji, a wyniki testu muszą być określone przez czytnik mikropłytek.
8. Wszystkie próbki, mycie płynów i różne odpady powinny być traktowane jako środki zakaźne.
9. Składniki różnych partii tego odczynnika nie powinny być mieszane.
10. Jeśli istnieje jakakolwiek różnica w języku angielskim angielskim, angielska instrukcja przeważa.
Obliczenie:
Przyjmując stężenie standardu jako odciętą i wartość OD jako rzędną, narysuj krzywą standardową na papierze współrzędnym i znajdź odpowiednie stężenie z krzywej standardowej zgodnie z wartością OD próbki; następnie pomnóż współczynnik rozcieńczenia; Oblicz równanie regresji liniowej krzywej standardowej wartości OD, zastąp wartość OD próbki na równanie, oblicz stężenie próbki i pomnóż ją przez współczynnik rozcieńczenia, aby uzyskać faktyczne stężenie próbki.
(Ten obraz jest tylko w celach informacyjnych)
Wydajność zestawu:
1. Współczynnik korelacji R między regresją liniową próbki a oczekiwanym stężeniem wynosi ponad 0,990.
2. Partia i zatwierdzenie wynoszą odpowiednio mniej niż 9% i 11%
Zakres egzaminu:
1pg / ml -45pg / ml
Warunki przechowywania i okres ważności:
1. Przechowuj zestaw: 2-8 ℃.
2. Ważność: 6 miesięcy