Anticorpo anti-HCG humano IgA (HCG-IGA) ELISA
Instruções de kit para uso Este reagente é apenas para uso da pesquisa
Objetivo: Este kit é usado para determinar o conteúdo do anticorpo anti-HCG IgA (HCG-IGA) em soro humano, plasma e amostras líquidas relacionadas.
Princípio experimental:
Este kit usa o método de sanduíche de anticorpo duplo para determinar o nível de anticorpo anti-HCG humano IgA (HCG-IGA) na amostra. As placas microporosas foram revestidas com anticorpo purificado de anticorpo anti-HCG IgA (HCG-IGA) para preparar anticorpos em fase sólida. O anticorpo anti-HCG IgA (HCG-IGA) foi adicionado ao micro-células revestidas com o MAB por sua vez e depois rotulado com HRP, o anticorpo anti-humano de cabra se liga para formar um complexo anticorpo marcado com anticorpo-antígeno-entranço. Após a lavagem completa, o substrato TMB é adicionado para o desenvolvimento de cores. O TMB é convertido em azul sob a catálise da enzima HRP e no amarelo final sob a ação do ácido. A profundidade da cor está positivamente correlacionada com o anticorpo anti-HCG IgA (HCG-IGA) na amostra. A absorvância (valor de OD) foi medida com um leitor de microplacas a um comprimento de onda de 450 nm, e a concentração de anticorpo anti-HCG humano (HCG-IGA) na amostra foi calculado por uma curva padrão.
Composição do kit:
Composição do kit 48 Configuração do poço 96 Instruções de armazenamento de configuração do poço 1 Parte 1 Parte de placa de vedação Filme 2 (48) 2 peças (96)
Um saco selado e uma placa de revestimento marcada com enzima 1 × 48 1 × 96 2-8 ℃ Padrão preservado: 54pg / ml 0,5ml × 1 garrafa 0,5ml × 1 diluente padrão preservado 1,5ml × 2-8 ℃ × 1 garrafa de 1.5 ML × 1 garrafa de reagentes marcados com enzima armazenados em 2-8 ℃ 3 ml × 1 garrafa de 6 ml × 1 garrafas de diluente de amostra a 2-8 ℃ 3 ml × 1 garrafa de 6 ml × 1 garrafas de armazenamento de cores em 2 -8 ℃ Reagente Uma solução 3 ml × 1 garrafa 6 ml × 1 garrafa 2-8 ° C Solução de armazenamento B Solução B 3 ml × 1 garrafa 6 ml × 1 garrafa 2-8 ° C Solução de parada de armazenamento 3ml × 1 garrafa 6ml × 1 garrafa 2- Armazene a solução de lavagem concentrada em 8 ℃ (20ml × 20 vezes) × 1 garrafa (20ml × 30 vezes) × 1 garrafa a 2-8 ℃
1. Soro: o sangue da temperatura ambiente coagula naturalmente por 10-20 minutos, centrifugado por cerca de 20 minutos (2000-3000 rpm). Colete o sobrenadante com cuidado e a centrífuga novamente se um precipitado aparecer durante o armazenamento.
2. Plasma: EDTA ou citrato de sódio devem ser selecionados como anticoagulante de acordo com os requisitos da amostra, misturados por 10 a 20 minutos e centrifugados por cerca de 20 minutos (2000-3000 rpm). Colete o sobrenadante com cuidado. Se um precipitado formar durante o armazenamento, ele deve ser centrifugado novamente.
3. Urina: coletada em tubos estéreis e centrifugada por cerca de 20 minutos (2000-3000 rpm). Colete o sobrenadante com cuidado. Se um precipitado formar durante o armazenamento, centrífuga novamente. Pleural e ascite, implementação de referência de líquido cefalorraquidiano.
4. Sobrenadante da cultura de células: Ao detectar componentes secretados, colete com um tubo estéril. Centrífuga por cerca de 20 minutos (2000-3000 rpm). Colete o sobrenadante com cuidado. Ao detectar os componentes dentro das células, dilua a suspensão celular com PBS (pH7.2-7.4) e a concentração celular atingirá cerca de 1 milhão / ml. Por meio de congelamento e descongelamento repetidos, as células são destruídas e os componentes intracelulares são liberados. Centrífuga por cerca de 20 minutos (2000-3000 rpm). Colete o sobrenadante com cuidado. Se um precipitado formar durante o armazenamento, ele deve ser centrifugado novamente.
5. Organize a amostra: depois de cortar a amostra, pese -a. Adicione uma certa quantidade de PBS, Ph7.4. Congele rapidamente e economize com nitrogênio líquido para uso posterior. Depois que a amostra derrete, ele ainda mantém uma temperatura de 2-8 ° C. Adicione uma certa quantidade de PBS (ph7.4) e homogeneize a amostra com um manual ou homogeneizador. Centrífuga por cerca de 20 minutos (2000-3000 rpm). Colete o sobrenadante com cuidado. Após a alíquota, uma parte deve ser testada e o restante é congelado para uso futuro.
6. A amostra deve ser extraída o mais rápido possível após a coleta. A extração deve ser realizada de acordo com a literatura relevante. O experimento deve ser realizado o mais rápido possível após a extração. Se o teste não puder ser realizado imediatamente, a amostra poderá ser armazenada em -20 ℃, mas o congelamento e o degelo repetidos devem ser evitados.
7. A amostra contendo NAN3 não pode ser detectada porque a NAN3 inibe a atividade da peroxidase de rábano silvestre (HRP).
Passos:
1. Diluição e carregamento de produtos padrão: defina 10 poços padrão na placa revestida com enzima, adicione 100 μl dos produtos padrão nos primeiros e segundo poços e adicione os produtos padrão nos primeiros e segundo poços. 50μl de diluente, misture bem; Em seguida, pegue 100 μl do primeiro poço e o segundo poço e adicione -os ao terceiro e quarto poços, respectivamente, e adicione 50μl de solução de diluição padrão ao terceiro e quarto poços, respectivamente, misture bem e depois tome 50μl cada no terceiro e quarto poços e descarte -o e adicione 50 μl um aos quinto e sexto poços e adicione 50ul da solução de diluição padrão ao quinto e sexto poços, respectivamente, e misture bem; Após a mistura, pegue 50 μl dos quinto e sexto poços e adicione -os ao sétimo e oitavo poços, respectivamente. Em seguida, adicione 50μl de solução de diluição padrão aos sétimos e oitavos poços, respectivamente. Tire 50μl dos oito poços e adicione -os aos nono e décimo poços. Em seguida, adicione 50μl da solução de diluição padrão aos nono e décimo poços, respectivamente. Após a mistura, pegue 50 μl dos nono e décimo poços e descarte. (Após a diluição, o volume de cada poço é de 50μl e as concentrações são de 36 pg / ml, 24pg / ml, 12pg / ml, 6pg / ml, 3pg / ml).
2. Adicione amostras: configure poços em branco (os poços de controle em branco não adicionam amostras e reagentes enzimáticos, o restante das etapas são as mesmas) e os poços de amostra a serem testados. Adicione 40μl de diluente da amostra ao poço de amostra de teste da placa revestida por enzima e adicione 10μl da amostra de teste (a diluição final da amostra é 5 vezes). Adicione a amostra e adicione a amostra à parte inferior do poço da microplaca, tente não tocar na parede do poço, agite suavemente para misturar.
3. Incubação: Sele a placa com o filme de vedação e incubar a 37 ° C por 30 minutos.
4. Solução de mistura: diluir 30 vezes (20 vezes de 48T) Líquido de lavagem concentrado com água destilada 30 vezes (20 vezes de 48T) e depois use.
5. Lavagem: retire cuidadosamente o filme de vedação, descarte o líquido, gire, encha cada poço com a solução de lavagem, deixe -o ficar por 30 segundos e descartar, repita 5 vezes e seque.
6. Adicione enzima: adicione 50μl de reagente da etiqueta enzimática a cada poço, exceto bem em branco.
7. Incubação: a operação é a mesma que 3.
8. Lavagem: A operação é a mesma que 5.
9. Desenvolvimento de cores: adicione 50μl de desenvolvedor A a cada poço e adicione 50μl de desenvolvedor B, misture suavemente e exiba 37 ℃ por 15 minutos no escuro.
10. Terminar: adicione 50μl de solução de parada a cada poço para interromper a reação (neste momento o azul se transformará em amarelo).
11. Determinação: Meça a absorvância (valor de OD) de cada poço em sequência com o ar condicionado em branco em zero e 450 nm de comprimento de onda. A medição deve ser realizada dentro de 15 minutos após a adição da solução final.
Precauções:
1. O kit deve ser equilibrado à temperatura ambiente por 15 a 30 minutos antes de ser retirado do ambiente refrigerado. Se a placa revestida com etiqueta enzimática estiver fechada, a tira deverá ser armazenada em uma bolsa selada.
2. Os cristais podem ser precipitados no líquido de lavagem concentrado, que pode ser aquecido e dissolvido em banho -maria durante a diluição, e os resultados não serão afetados durante a lavagem.
3. O amostrador deve ser usado em cada etapa da adição de amostra, e a precisão deve ser verificada regularmente para evitar erros de teste. É melhor controlar o tempo de amostragem em 5 minutos. Se houver muitos espécimes, é recomendável usar uma pistola para adicionar amostras.
4. Faça uma curva padrão ao mesmo tempo de cada medição, é melhor fazer um orifício duplo. Se o conteúdo da substância a ser testado na amostra for muito alto (o valor da OD da amostra é maior que o valor de OD do primeiro poço do poço padrão), dilua -o com um certo múltiplo (n vezes) de a amostra diluente e depois determine. Múltiplo (× n × 5).
5. O filme de vedação é limitado ao uso único para evitar a contaminação cruzada.
6. Por favor, mantenha o substrato longe da luz.
7. Siga estritamente as instruções e os resultados do teste devem ser determinados pelo leitor de microplacas.
8. Todas as amostras, líquidos de lavagem e vários resíduos devem ser tratados como agentes infecciosos.
9. Os componentes de diferentes lotes deste reagente não devem ser misturados.
10. Se houver alguma diferença no manual inglês, o manual inglês prevalecerá.
Cálculo:
Tomando a concentração do padrão como a abcissa e o valor de OD como as ordenadas, desenhe uma curva padrão no papel de coordenadas e encontre a concentração correspondente da curva padrão de acordo com o valor da DO da amostra; Em seguida, multiplique pelo fator de diluição; Calcule a equação de regressão linear da curva padrão com o valor da OD, substitua o valor da DO da amostra na equação, calcule a concentração da amostra e multiplique -a pelo fator de diluição para obter a concentração real da amostra.
(Esta imagem é apenas para referência)
Desempenho do kit:
1. O coeficiente de correlação R entre a regressão linear da amostra e a concentração esperada é superior a 0,990.
2. O lote e a aprovação devem ser inferiores a 9% e 11%, respectivamente
Faixa de exames:
1pg / ml -45pg / ml
Condições de armazenamento e período de validade:
1. Armazene o kit: 2-8 ℃.
2. Validade: 6 meses