Mänsklig anti-HCG-antikropp IgA (HCG-IGA) ELISA
Kitinstruktioner för användning av detta reagens är endast för forskningsanvändning
Syfte: Detta kit används för att bestämma innehållet i anti-HCG-antikropp IgA (HCG-IGA) i humant serum, plasma och relaterade vätskeprover.
Experimentell princip:
Detta kit använder den dubbla antikroppsmörgåsmetoden för att bestämma nivån av human anti-HCG-antikropp IgA (HCG-IGA) i provet. Mikroporösa plattor belades med renad human anti-HCG-antikropp IgA (HCG-IGA) antikropp för att framställa antikroppar för fast fas. Anti-HCG-antikropp IgA (HCG-IGA) sattes till de mikrovågor belagda med MAb i sin tur och märktes sedan med HRP-antikroppskomplexet för att bilda en antikropp-antigen-enzymmärkta antikroppskomplex. Efter grundlig tvätt tillsätts substrat TMB för färgutveckling. TMB omvandlas till blått under katalysen av HRP -enzym och till den sista gula under verkan av syra. Färgdjupet är positivt korrelerat med anti-HCG-antikroppen IgA (HCG-IGA) i provet. Absorbansen (OD-värdet) mättes med en mikroplattläsare vid en våglängd av 450 nM, och koncentrationen av human anti-HCG-antikropp IgA (HCG-IGA) i provet beräknades med en standardkurva.
Kitkomposition:
Kit Composition 48 Well Configuration 96 Well Configuration Storage Instruktioner 1 Del 1 Del Tätningsplattfilm 2 bitar (48) 2 bitar (96)
En förseglad påse och en enzymmärkta beläggningsplatta 1 × 48 1 × 96 2-8 ℃ Konserverad standard: 54pg / ml 0,5 ml × 1 flaska 0,5 ml × 1 bevarad standardutspädningsmedel 1,5 ml × 2-8 ℃ × 1 flaska av 1,5 massa flaska 0,5 ml × 1 bevarad standardutspädningsmedel 1,5 ml × 2-8 ℃ × 1 flaska av 1,5 massa flaska 0,5 ml × 1 ml × 1 flaska enzymmärkta reagens lagrade vid 2-8 ℃ 3 ml × 1 flaska 6 ml × 1 flaskor med provutspädningsmedel vid 2-8 ℃ 3 ml × 1 flaska 6 ml × 1 flaskor färglagring vid 2 -8 ℃ Reagens En lösning 3 ml × 1 flaska 6 ml × 1 flaska 2-8 ° C Lagringsutvecklare B-lösning 3 ml × 1 flaska 6 ml × 1 flaska 2-8 ° C Lagring Lösning 3 ml × 1 flaska 6 ml × 1 flaska 2- Förvara den koncentrerade tvättlösningen vid 8 ℃ (20 ml × 20 gånger) × 1 flaska (20 ml × 30 gånger) × 1 flaska vid 2-8 ℃
1. Serum: Blod för rumstemperatur koagulerar naturligt i 10-20 minuter, centrifugerat i cirka 20 minuter (2000-3000 rpm). Samla supernatanten noggrant och centrifugera igen om en fällning visas under lagring.
2. Plasma: EDTA eller natriumcitrat bör väljas som antikoagulanti enligt kraven i provet, blandat i 10-20 minuter och centrifugeras i cirka 20 minuter (2000-3000 rpm). Samla supernatanten noggrant. Om en fällning bildas under lagring, bör den centrifugeras igen.
3. Urin: Uppsamlad i sterila rör och centrifugerade i cirka 20 minuter (2000-3000 rpm). Samla supernatanten noggrant. Om en fällning bildas under lagring, centrifug igen. Pleural och ascites, implementering av cerebrospinal vätska referens.
4. Cellodlingssupernatant: När du upptäcker utsöndrade komponenter, samla med ett sterilt rör. Centrifug i cirka 20 minuter (2000-3000 rpm). Samla supernatanten noggrant. Vid detektering av komponenterna inuti cellerna, späd cellsuspensionen med PBS (pH7.2-7.4) och cellkoncentrationen kommer att nå cirka 1 miljon / ml. Genom upprepad frysning och upptining förstörs cellerna och de intracellulära komponenterna frigörs. Centrifug i cirka 20 minuter (2000-3000 rpm). Samla supernatanten noggrant. Om en fällning bildas under lagring, bör den centrifugeras igen.
5. Organisera provet: När du har skärat provet, väga det. Lägg till en viss mängd PBS, pH7.4. Frys snabbt och spara med flytande kväve för senare användning. Efter att provet smälter upprätthåller det fortfarande en temperatur på 2-8 ° C. Tillsätt en viss mängd PBS (pH7.4) och homogeniserar provet med en manuell eller homogenisator. Centrifug i cirka 20 minuter (2000-3000 rpm). Samla supernatanten noggrant. Efter alikvot ska en del testas och resten är fryst för framtida användning.
6. Provet bör extraheras så snart som möjligt efter insamling. Extraktionen bör genomföras enligt relevant litteratur. Experimentet bör utföras så snart som möjligt efter extraktion. Om testet inte kan utföras omedelbart kan provet lagras vid -20 ℃, men upprepad frysning och tining bör undvikas.
7. Provet som innehåller NAN3 kan inte detekteras eftersom NAN3 hämmar aktiviteten hos pepparrotsperoxidas (HRP).
Steg:
1. Utspädning och lastning av standardprodukter: Ställ in 10 standardbrunnar på enzymbelagda plattor, tillsätt 100 ul av standardprodukterna i första och andra brunnarna och tillsätt sedan standardprodukterna i första och andra brunnarna. 50 ul utspädningsmedel, blanda väl; Ta sedan 100 ul från den första brunnen och den andra brunnen och tillsätt dem till den tredje respektive fjärde brunnarna, och tillsätt sedan 50 ul standardutspädningslösning till den tredje respektive fjärde brunnarna, blanda och ta sedan 50 ul vardera i tredje och fjärde brunnarna och kassera det, tillsätt sedan 50 ul vardera till de femte och sjätte brunnarna, och tillsätt sedan 50UL av standardutspädningslösningen till femte respektive sjätte brunnarna och blanda väl; Efter blandningen, ta 50 ul från femte och sjätte brunnarna och tillsätt dem till den sjunde respektive åttonde brunnarna. Tillsätt sedan 50 ul standardutspädningslösning till den sjunde respektive åttonde brunnarna. Ta 50 ul från de åtta brunnarna och tillsätt dem till de nionde och tionde brunnarna. Tillsätt sedan 50 ul av standardutspädningslösningen till de nionde respektive tionde brunnarna. Efter blandningen, ta 50 ul från de nionde och tionde brunnarna och kassera. (Efter utspädning är volymen för varje brunn 50 ul, och koncentrationerna är 36pg / ml, 24pg / ml, 12pg / ml, 6pg / ml, 3pg / ml).
2. Lägg till prover: Ställ in tomma brunnar (de tomma kontrollbrunnarna lägger inte till prover och enzymreagens, resten av stegen är desamma) och provbrunnarna som ska testas. Tillsätt 40 ul provutspädningsmedel till testprovet i den enzymbelagda plattan och tillsätt sedan 10 ul av testprovet (den slutliga utspädningen av provet är 5 gånger). Tillsätt provet och tillsätt provet i botten av mikroplattans brunn, försök att inte röra vid väggen i brunnen, skaka försiktigt för att blanda.
3. Inkubation: Försegla plattan med tätningsfilmen och inkubera vid 37 ° C i 30 minuter.
4. Blandningslösning: Späd 30 gånger (20 gånger 48T) koncentrerad tvättvätska med destillerat vatten 30 gånger (20 gånger 48T) och använd sedan.
5. Tvätt: Skala försiktigt av tätningsfilmen, kasta vätskan, snurra torrt, fyll varje brunn med tvättlösningen, låt den stå i 30 sekunder och kassera, upprepa 5 gånger och klappa torrt.
6. Tillsätt enzym: Tillsätt 50 ul enzymetikettreagens till varje brunn, utom tomt brunn.
7. Inkubation: Operationen är densamma som 3.
8. Tvätt: operationen är densamma som 5.
9. Färgutveckling: Tillsätt 50 ul utvecklare A till varje brunn och tillsätt sedan 50 ul utvecklare B, blanda försiktigt och visas vid 37 ℃ i 15 minuter i mörkret.
10. Avslutning: Tillsätt 50 ul stopplösning till varje brunn för att stoppa reaktionen (just nu kommer det blå att bli gult).
11. Bestämning: Mät absorbansen (OD -värdet) för varje brunn i sekvens med den tomma luftkonditioneringen vid noll och 450 nm våglängd. Mätningen bör utföras inom 15 minuter efter tillsats av den slutliga lösningen.
Försiktighetsåtgärder:
1. Satsen ska jämviktas vid rumstemperatur i 15-30 minuter innan den tas ut från den kylda miljön. Om enzymetikettbelagd platta är oöppnad bör remsan lagras i en förseglad väska.
2. Kristaller kan fällas ut i den koncentrerade tvättvätskan, som kan upphettas och lösas i ett vattenbad under utspädning, och resultaten påverkas inte under tvätt.
3. Provtagaren bör användas vid varje steg i provtillägget och noggrannheten bör regelbundet kontrolleras för att undvika testfel. Det är bäst att kontrollera provtagningstiden inom 5 minuter. Om det finns många exemplar rekommenderas det att använda en volleypistol för att lägga till prover.
4. Gör en standardkurva samtidigt för varje mätning, det är bäst att göra ett dubbelhål. Om innehållet i ämnet som ska testas i provet är för högt (OD -värdet på provet är större än OD -värdet på den första brunnen i standardbrunnen), vänligen utspäd det med en viss flera (n gånger) av Provutspädningsmedel och bestäm sedan det. Flera (× n × 5).
5. Tätningsfilmen är begränsad till engångsanvändning för att undvika korsföroreningar.
6. Håll underlaget borta från ljuset.
7. Följ strikt instruktionerna och testresultaten måste bestämmas av mikroplattläsaren.
8. Alla prover, tvättvätskor och olika avfall bör behandlas som smittämnen.
9. Komponenterna i olika partier i detta reagens får inte blandas.
10. Om det finns någon skillnad med den engelska manualen, ska den engelska manualen råda.
Beräkning:
Genom att ta koncentrationen av standarden som Abscissa och OD -värdet som ordinat, rita en standardkurva på koordinatspapperet och hitta motsvarande koncentration från standardkurvan enligt OD -värdet på provet; multiplicera sedan med utspädningsfaktorn; Beräkna den linjära regressionsekvationen för standardkurvan med OD -värdet, ersätt OD -värdet på provet i ekvationen, beräkna provkoncentrationen och multiplicera den med utspädningsfaktorn för att erhålla den faktiska koncentrationen av provet.
(Den här bilden är endast för referens)
Kitprestanda:
1. Korrelationskoefficienten R mellan den linjära regressionen av provet och den förväntade koncentrationen är mer än 0,990.
2. Batch och godkännande ska vara mindre än 9% respektive 11%
Examensområde:
1pg / ml -45pg / ml
Lagringsförhållanden och giltighetsperiod:
1. Förvara satsen: 2-8 ℃.
2. Giltighet: 6 månader